每升黑木耳发酵液能提取多糖244mg,黑木纯度为85.3%,耳胞FT-IR光谱显示,外多微生黑木耳胞外多糖为具有典型β-吡喃糖结构的糖对态及复杂多糖(图1),官能团分析表明,小鼠响在3419cm-1处的肠道宽峰是-OH伸缩振动吸收峰,2973cm-1和2918cm-1处的免疫弱吸收带是-CH伸缩振动吸收峰,1735cm-1和1638cm-1处的调节的影吸收峰表明含有糖醛酸,1383cm-1是黑木-CH弯曲振动吸收峰,1078cm-1和1048cm-1处的耳胞吸收峰是C-O-H和C-O-C中的C-O引起的振动吸收;880cm-1是β-糖苷键的特征吸收峰。
黑木耳胞外多糖经过酸水解和衍生化后,利用HPLC分析其单糖组成。糖对态及结果显示,小鼠响葡萄糖和木糖为其主要的肠道单糖组分(物质的量比为53.85%和25.05%),还有少量的免疫甘露糖、果糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸(表1)。与红外光谱分析结果一致,黑木耳胞外多糖是由多种单糖组分构成的杂合多糖。
与对照组相比,灌胃黑木耳胞外多糖后小鼠体重无明显变化(图2)。脏器系数是反映动物器官发育的重要指标,可直观反映受试物对动物存在的毒害作用。本研究通过称量小鼠各脏器组织质量,计算其脏器系数。黑木耳胞外多糖对小鼠脏器系数的影响见表2,统计分析显示,样品组与对照结果无显著性差异(P>0.05)。上述试验表明,灌胃黑木耳胞外多糖不会引起小鼠脏器发生病理性异常。
本试验利用微生物16SrRNA基因测序技术,探索了灌胃黑木耳胞外多糖小鼠肠道菌群的变化情况。测序所得原始数据经筛选过滤后,对获得的序列进行可操作单元分析(OTU)归并划分,采用Greengenes数据库进行注释,通过多种多变量统计学分析工具对不同样本(组)微生物群落结构差异进行分析,得到了小鼠肠道微生物16SrRNA在属水平OTU序列的相对丰度(图3)。通过Metastats对样本组间序列量差异的比较检验发现,与对照组相比,拟杆菌属和罗氏菌属显著增加(P<0.05),拟杆菌属在多糖组肠道微生物群中占(10.31±1.5)%,而对照组为(5.4±1.38)%;罗氏菌属在多糖组中占(0.17±0.07)%,而在对照组中未检测到。
肠道微生物通过膳食纤维的发酵和短链脂肪酸(SCFAs)的产生来提高能量利用率,从而提高宿主代谢效率。本试验将小鼠粪便样品按照冷冻干燥粪便样品,准确称取50mg样品,加入1.2mL磷酸盐缓冲液(pH7.3)混匀,4℃14000r/min离心20min,吸取上清液至5mL离心管中。每200μL上清加入0.1mL的稀释后硫酸(体积分数50%),充分混匀3min,用2mL二氯甲烷(色谱级)进行萃取,4℃静置2h,然后用0.22μm有机滤膜过滤。采用气相色谱(GC)检测样品中短链脂肪酸的含量,样品提取方法参照Zhao等并做部分修改。GC分析采用常规HP-FFAP(25m×0.32mm,0.5μm)配置柱,程序设定参照贾益群等在生物样品脂肪酸提取与分析的研究结果,并调整其分流比为20∶1。SCFA标准品溶液的配置以及标准曲线绘制参照孟拓等对气相色谱-质谱联用法分析肠道炎小鼠短链脂肪酸代谢研究结果。
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